1、2/3肝切除誘導(dǎo)的肝再生模型的鑒定和評價的技術(shù)方法和指標(biāo)體系主要分三個層面：

（1）整體水平：小鼠的整體健康狀況良好，在術(shù)后各個時間點小鼠的肝臟質(zhì)量能夠逐漸恢復(fù)。

（2）病理水平：對肝臟組織進行病理學(xué)染色，檢測肝臟細胞的增殖水平。

（3）分子水平：檢測細胞周期相關(guān)基因mRNA和蛋白水平。

2、該模型主要是采用2003年時Greene和Puder開發(fā)的小鼠部分肝切除技術(shù)，結(jié)合后續(xù)不斷改進的方法，增加鎮(zhèn)痛劑加熱墊等的使用。

3、該模型的整體操作過程相對比較簡單，難點在于如何保持手法的一致性，以保證結(jié)果的差異不是由于操作上的不同引起的。肝細胞進入細胞周期并在組織丟失后再生的能力為研究肝細胞增殖和器官再生的調(diào)控提供了一個有效的模型，為終末期肝臟疾病需要行切除手術(shù)患者的術(shù)后治療提供了更加豐富的理論研究基礎(chǔ)，從而促進新的治療手段的開發(fā)。

本模型制作不涉及微生物。

動物模型制備過程中遵循福利和各項管理度，并未傳代，于SPF屏障環(huán)境下飼養(yǎng)，動物無逃逸。

模型制備完成后，在進行病理染色析對環(huán)境和生態(tài)并未產(chǎn)明顯影響。

1、細胞/基因/病原/蛋白表達/免疫組化鑒定、病原學(xué)檢查信息

2/3肝切除手術(shù)誘導(dǎo)的小鼠肝細胞增殖，通過H&E和BrdU染色可見術(shù)后小鼠肝臟細胞明顯的增殖，統(tǒng)計肝重體重比也發(fā)現(xiàn)肝臟質(zhì)量的恢復(fù)（圖1）。

圖1. 模型小鼠肝臟細胞有絲分裂和增殖（A-B）明顯增加，肝重體重比也逐漸恢復(fù)（C）。（PHx, 2/3 partial hepatectomy;LW, liver weight; BW, Body weight）。

2、表型分析（包括生理生化、解剖學(xué)、生物學(xué)特征等）

大體解剖并未發(fā)現(xiàn)小鼠各臟器有明顯異常。

3、影像/行為/臨床/病理表型

模型小鼠的行為未出現(xiàn)明顯異常。

評價方法：

1）小鼠術(shù)后狀態(tài)的恢復(fù)。

通過觀察小鼠活動狀態(tài)及進食情況判斷2/3肝切除手術(shù)術(shù)后小鼠整體健康狀況是否恢復(fù)。

2)肝臟細胞增殖及肝臟生長情況。

該模型通過在術(shù)后不同時間點取材，一方面通過對小鼠肝臟質(zhì)量和體重進行稱重，統(tǒng)計肝重體重比，另一方面通過對肝臟組織進行病理染色判斷肝臟細胞的增殖和肝臟的生長情況。

評價指標(biāo)：

主要指標(biāo)：

1）肝重體重比逐漸恢復(fù)。

2）肝臟細胞有絲分裂在增殖期顯著增加。

3）肝臟細胞增殖在增殖期顯著增加。

重要指標(biāo)：小鼠活動、進食及體重變化。

實驗材料（實驗動物、試劑、儀器）

動物：C57BL/6小鼠

試劑：異氟烷

器械及儀器：異氟烷汽化器、半彎曲顯微手術(shù)剪、持針器、直頭無齒微型解剖、彎頭解剖鑷、16cm直頭組織剪、針托、回形針（用于自制拉鉤）、棉簽、酒精棉球、5ml注射器針頭兩個（固定拉鉤）、醫(yī)用膠布（固定小鼠）、聚苯乙烯泡沫塑料墊、1ml注射器（液體麻醉注射用）、3-0絲線（結(jié)扎肝葉）、4-0絲線（縫合腹膜）、縫合皮膚：訂書機閉合/4-0尼龍線縫合

實驗環(huán)境

動物手術(shù)在SPF動物實驗室生物安全柜中操作。

實驗操作規(guī)程

1）抓取小鼠，稱重并記錄。

2）左手固定住小鼠，右手持裝有適量異氟烷的麻醉裝置，將小鼠的口鼻部暴露在異氟烷氣體中。麻醉過程中應(yīng)持續(xù)觀察小鼠的反應(yīng)，掌握好麻醉深度。

3）待完全麻醉后，將小鼠固定在手術(shù)臺上，術(shù)中持續(xù)給予吸入麻醉，維持適當(dāng)?shù)穆樽砩疃?。用剃毛機剔除小鼠腹部的毛發(fā)，75%乙醇消毒后準(zhǔn)備手術(shù)。

4）在小鼠腹部靠近肝臟的位置，用剪刀沿著腹部中線將表面皮膚剪開一個小口（長度約為1.5-2.0cm），用鑷子小心夾起小鼠腹膜，沿著剛才的切口將腹膜剪開，暴露腹腔，注意避開血管。

5）用浸泡在PBS中滅菌過的棉簽小心的將肝臟分離出來，用眼科剪剪斷和肝臟相連的韌帶，充分游離、暴露肝臟。

6）用浸泡在PBS中的醫(yī)用縫合線（5-0）從根部將小鼠左側(cè)葉結(jié)扎，隨即將該葉剪下。接著用同樣的方法將中間葉一并結(jié)扎并剪下。操作過程注意動作輕柔，避免損傷其他肝葉，線要扎緊，避免脫落。

7）用棉簽將殘余肝臟小心的送回至原有位置，隨后依次用5-0和4-0的醫(yī)用縫合線縫合腹膜和皮膚。縫好后，消毒縫合口和周圍皮膚，停止麻醉。

8）手術(shù)結(jié)束后將小鼠放在37度恒溫加熱墊上等待蘇醒，最后將蘇醒后的小鼠安置在干凈的鼠籠中正常飼養(yǎng)、觀察。

肝病影響著全世界數(shù)百萬人。在大多數(shù)發(fā)達國家，由于疾病預(yù)防、診斷和治療方面的現(xiàn)代進步，病毒性肝炎的發(fā)病率正在下降。在包括中國在內(nèi)的許多國家，擴大乙肝病毒系統(tǒng)免疫規(guī)劃也大大降低了新病例數(shù)量。但是，隨著生活水平的提高，包括非酒精性脂肪肝和酒精相關(guān)肝病在內(nèi)的代謝性肝病的患病率逐漸上升，這些肝病最終可能導(dǎo)致更多的終末期肝病(肝功能衰竭、肝硬化和肝癌)的發(fā)生[9]。根據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)2018年的一份報告，中國的肝癌發(fā)病率居世界第九位，僅次于蒙古、埃及、岡比亞、越南、老撾、柬埔寨、幾內(nèi)亞和泰國等少數(shù)發(fā)展中或新興經(jīng)濟體。但從中國的人口規(guī)模來看，中國無疑是世界上肝癌患者最多的國家(2019年14億)[10]。由于原發(fā)性肝癌早期缺乏明顯的特異癥狀，常規(guī)的放療和化療的治療效果無明顯效果，肝臟病變部位切除是治療的重要途徑。如何有效地發(fā)掘肝臟再生潛能是術(shù)后病人得以存活的關(guān)鍵，因此，對肝臟的再生機理進行研究對于肝臟疾病的治療具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。

2/3肝切除誘導(dǎo)的肝再生動物模型，最早是1931年由Higgins和Anderson在大鼠中使用，他們切除了大鼠四葉肝臟中的兩葉（約占整個肝臟的2/3），用于研究肝臟再生。在后續(xù)的研究中因為大鼠比小鼠大，操作相對方便，所以大多數(shù)人選擇大鼠進行肝再生的研究[11-14]。2003年時Greene和Puder為開發(fā)了一種新穎、快速且安全的小鼠部分肝切除技術(shù)[15]，他們確定了小鼠肝臟七個葉的相對貢獻，并切出來左前葉、左后葉和右前葉切除，大約占總肝臟體積的68%。同時作者還將手術(shù)的麻醉方法改為異氟烷氣體麻醉代替?zhèn)鹘y(tǒng)的三溴乙醇、氯胺酮和戊巴比妥，并把小鼠放在加熱墊上防止小鼠體溫流失，從而減少小鼠因手術(shù)引起的死亡。隨后小鼠2/3肝切除技術(shù)逐漸成熟[16-18]。其中，2008年時Claudia Mitchell 和Holger Willenbring對小鼠2/3肝切除手術(shù)進行了進一步的改進：作者在進行肝葉切除時，將三步改成兩步，首先切除小鼠肝臟的左后葉，再將小鼠的中間葉（左前葉和右前葉）一起切除，這種手術(shù)方法會將小鼠膽囊摘除[18]。2014年時該課題組對小鼠的鎮(zhèn)痛、麻醉劑的選擇及體溫的控制也給出了如下補充：（1）為了防止麻醉下的小鼠體溫過低，在整個手術(shù)過程中將小鼠放在暖墊上。（2）術(shù)后關(guān)閉腹膜后，在關(guān)閉皮膚前，將0.25% (wt/vol)鹽酸布比卡因溶液(最大劑量8 mg/kg)滴于切口處。（3）術(shù)后使用鹽酸丁丙諾啡0.1 mg/kg維持鎮(zhèn)痛，之后每8-12小時注射一次，直到術(shù)后第2天結(jié)束[19]。后續(xù)關(guān)于小鼠肝再生模型的構(gòu)建多采用以上兩種方法。