造血干細(xì)胞是最早發(fā)現(xiàn)和鑒定的干細(xì)胞，是研究干細(xì)胞生物學(xué)功能及其調(diào)節(jié)的范式。也是研究各種疾病病理生理機(jī)制及預(yù)防治療措施的重要模型。競(jìng)爭(zhēng)性骨髓移植模型在造血干細(xì)胞功能研究及骨髓移植相關(guān)問(wèn)題研究中應(yīng)用廣泛。

移植過(guò)程中，應(yīng)注意一些實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)。移植前受體小鼠的清髓一般選擇致死劑量照射，C57BL/6J背景小鼠一般照射總劑量為9.0 Gy，可分2次照射，每次照射劑量為4.5 Gy，中間間隔2 h。照射后2 h 左右進(jìn)行群體細(xì)胞注射，其移植成功效率更高。一般選擇2.5 × 105受體同源的全骨髓細(xì)胞作為保護(hù)細(xì)胞，保護(hù)細(xì)胞數(shù)量過(guò)多會(huì)降低供體來(lái)源細(xì)胞的檢出效率，過(guò)少則無(wú)法保證致死劑量照射小鼠短期的存活。

在制備模型過(guò)程中，使用的輻照儀是自屏蔽的。使用時(shí)有自動(dòng)安全保護(hù)設(shè)置，周圍環(huán)境是安全的。

在骨髓移植后1個(gè)月、3個(gè)月分別采血，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析外周血中供體細(xì)胞嵌合率：在EP管中加入抗凝劑0.1M EDTA 10ul，從眼后靜脈叢取血30ul，標(biāo)記抗體，使用staining medium調(diào)整染色體積50ul，冰上孵育30min。（4色以上，同時(shí)配備單一抗體染色對(duì)照管）。每管加入1ml BD Pharm Lyse裂解紅細(xì)胞，室溫孵育5-10min，1500rpm/min 離心5min。棄上清，加入1ml staining medium洗一遍；200ul重懸，上機(jī)檢測(cè)不同分型造血免疫細(xì)胞中45.1和45.2細(xì)胞的比例。

模型評(píng)價(jià)方法：在移植后1個(gè)月、2個(gè)月（或者3個(gè)月）采集外周血，流式方法檢測(cè)供體造血細(xì)胞的嵌合率。1個(gè)月時(shí)嵌合率在70~80%；2~3個(gè)月時(shí)嵌合率是40~50%。

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性 C57BL/6J-Ly-5.1 (Ly5.1) 小鼠購(gòu)自實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)研究所（PUMC，北京，中國(guó)）；C57BL/6J J（Ly5.2）小鼠購(gòu)自Vital River（中國(guó)北京）。小鼠 8-12 周齡，體重 20-25 克。

2.試劑流式檢測(cè)用抗體均是eBioscience產(chǎn)品。

3.動(dòng)物模型建立方法

3.1移植前準(zhǔn)備：小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，墊料高溫消毒，隔日更換，飼料經(jīng)60Co照射滅菌，飲水為過(guò)濾的無(wú)菌水；

3.2全身照射：C57BL/6J-Ly-5.2受體小鼠在接受骨髓移植前接受致死劑量的放射線照射。采用X或γ射線做全身照射，劑量率0.5-1Gy/min，總劑量9Gy（亦可分兩次照射，每次劑量4.5Gy，間隔時(shí)間2~5小時(shí)，以減少放射線對(duì)器官的損傷）；

3.3供體小鼠骨髓細(xì)胞的分離：從C57BL/6J-Ly-5.1小鼠骨骼中沖出骨髓有核細(xì)胞作為供體細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)至2×107個(gè)/ml；

3.4制備植入細(xì)胞混合液：將從C57BL/6J-Ly-5.1小鼠中收集的細(xì)胞與同樣方法收集的C57BL/6J-Ly-5.2小鼠按1：1混合；

3.5移植：將制備的植入細(xì)胞混合液通過(guò)眼后靜脈叢或尾靜脈注射注入全身照射處理后的C57BL/6J-Ly-5.2受體小鼠，每只受體小鼠接受注射液體總量控制在200-300μl。含單個(gè)核骨髓細(xì)胞約1×106個(gè)；

3.6移植后受體給予抗生素一周。飲水中添加乳酸左氧氟沙星0.5mg/ml，建議藥物使用注射液劑型，以避免藥物阻塞飲水口。移植后注意飲食飲水補(bǔ)給，以提高移植成活率。

1、造模因素信息

本模型受體小鼠須接受致死劑量電離輻射。

電離輻射是指攜帶足以使物質(zhì)原子或分子中的電子成為自由態(tài)，從而使這些原子或分子發(fā)生電離現(xiàn)象的能量的輻射。電離輻射的特點(diǎn)是波長(zhǎng)短、頻率高、能量高。電離輻射可以從原子、分子或其他束縛狀態(tài)中放出（ionize）一個(gè)或幾個(gè)電子。電離輻射是一切能引起物質(zhì)電離的輻射的總稱，其種類很多，高速帶電有α粒子、β粒子、質(zhì)子，不帶電粒子有中子以及X射線、γ射線。本實(shí)驗(yàn)中使用的小動(dòng)物專用的X射線、γ射線照射設(shè)備。

2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息

C57BL/6J小鼠，攜帶CD45.1和CD45.2等位基因。分別作為供體小鼠和受體小鼠。

3、研究背景

1961年加拿大科學(xué)家James Till和ErnestMcCulloch在為收到射線照射后小鼠輸注骨髓細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)了小鼠脾結(jié)節(jié)，提出了造血干細(xì)胞的基本特征，奠定了造血干細(xì)胞生物學(xué)的基礎(chǔ)。此后各國(guó)科學(xué)家為分離純化造血干細(xì)胞以及檢測(cè)造血干細(xì)胞功能及調(diào)節(jié)機(jī)制，研究造血干細(xì)胞移植相關(guān)臨床問(wèn)題進(jìn)行了廣泛的研究。骨髓移植實(shí)驗(yàn)成為檢測(cè)造血干細(xì)胞自我更新和分化的能力的金標(biāo)準(zhǔn)。攜帶CD45.1和CD45.2等位基因的C57BL/6J小鼠培育成功為廣泛應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性骨髓移植實(shí)驗(yàn)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

1.Li C, Lu L, Zhang J, Huang S,Xing Y, Zhao M, Zhou D, Li D,Meng A. Granulocyte colony-stimulating factor exacerbates hematopoietic stem cell injury after irradiation. Cell Biosci.2015 Nov 25;5:65. doi: 10.1186/s13578-015-0057-3. eCollection 2015

2.Zhang H, Zhai Z, Wang Y, Zhang J, Wu H, Wang Y, Li C, Li D, Lu L, Wang X, Chang J, Hou Q, Ju Z, Zhou D, Meng A. Resveratrol Ameliorates Ionizing Irradiation-Induced Long-Term Hematopoietic Stem Cell Injury in Mice. Free Radic Biol Med., 2013, 54:40-50

3.Zhang J, Yang R,Zhou D, Rudolph KL,Meng A, JuZ. Exonuclease1isessentialformaintaininggenomicstabilityand theproliferativecapacityofneuralbut nothematopoieticstemcells. Stem Cell Res. 2014 , 12(1):250-9.

4.Hétu-Arbour R, Bouali S, Heinonen KM. Experimental Competitive Bone Marrow Transplant Assays. Methods Mol Biol. 2021;2185:195-214.

5.Cheng H, Liang PH, Cheng T. Mouse hematopoietic stem cell transplantation. Methods Mol Biol. 2013;976:25-35.