注意事項(xiàng)
1）操作人員應(yīng)具有基本的病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)工作經(jīng)驗(yàn)，盡量使用移液器與無菌一次性吸頭。
2）在殺菌試驗(yàn)中，每次均應(yīng)設(shè)置陽性對(duì)照。
3）如使用病毒載體進(jìn)行試驗(yàn)，可參照上述懸液定量試驗(yàn)程序，并遵照病毒學(xué)原理進(jìn)行適當(dāng)修改后使用。

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的試驗(yàn)脊髓灰質(zhì)炎病毒殺滅試驗(yàn)的評(píng)價(jià)規(guī)定
1）脊灰病毒滅活試驗(yàn)，可用于評(píng)價(jià)醫(yī)療器械、食具、物體表面和皮膚用化學(xué)消毒劑對(duì)病毒的滅活效果。病毒的滅活滴度，應(yīng)達(dá)到4個(gè)對(duì)數(shù)值。
2）在正常情況下，3次試驗(yàn)的平均滅活對(duì)數(shù)值≥4.00，可判為對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒污染物消毒的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)合格。同時(shí)，陽性對(duì)照組病毒滴度對(duì)數(shù)值應(yīng)在5~7之間。

脊髓灰質(zhì)炎病毒殺滅試驗(yàn)的計(jì)算
平均滅活對(duì)數(shù)值按下式計(jì)算：設(shè)陽性（(病毒）對(duì)照組平均病毒感染滴度的為No，試驗(yàn)（消毒）組平均病毒感染滴度為Nx。
平均滅活對(duì)數(shù)值= log No-log Nx

脊髓灰質(zhì)炎病毒殺滅脊髓灰質(zhì)炎懸液定量滅活試驗(yàn)的操作程序
1)從液氮中取出凍存的試驗(yàn)宿主細(xì)胞，在37℃溫水中迅速融化，并用細(xì)胞維持液洗滌兩次后，轉(zhuǎn)種于加有10ml完全培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶中。逐日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，在細(xì)胞長(zhǎng)滿單層時(shí)，用于消毒試驗(yàn)。
2)取出低溫凍存的脊髓灰質(zhì)炎-1毒株，37℃水浴融化，用細(xì)胞維持液作10倍稀釋，然后接種于含已經(jīng)長(zhǎng)滿單層細(xì)胞的細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，置37℃溫箱中，使與細(xì)胞吸附、生長(zhǎng)。逐日觀察病變，待3/4細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，收獲病毒。收獲時(shí)，將培養(yǎng)液取出，用超聲波或反復(fù)凍融破碎宿主細(xì)胞，盡快離心，并將含病毒的上清液按每管1.Oml 分裝于無菌離心管( 1.5ml）中，冷凍保存于-80℃?zhèn)溆谩?br> 3)取待測(cè)消毒劑，用滅菌硬水稀釋至所需濃度的1.25倍，于20℃±1℃水浴中備用。
4）取100μ 1有機(jī)干擾物質(zhì)與100μ 1病毒原液混合，于20℃+1℃水浴中作用5min，加入0.8ml待檢消毒劑，立即混勻并記時(shí)。作用規(guī)定時(shí)間，立即取出0.1ml，加入中和劑中混勻；或用經(jīng)鑒定合格的除藥方法處理。
5）陽性（病毒）對(duì)照組試驗(yàn)中，用無菌去離子水代替消毒劑。
6）各組分別進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，可采用終點(diǎn)稀釋法或噬斑法進(jìn)行。
7)試驗(yàn)重復(fù)3次。
8）終點(diǎn)稀釋法操作步驟：先用細(xì)胞維持培養(yǎng)液對(duì)待滴定樣本做10倍系列稀釋，然后在96孔培養(yǎng)板上滴定各稀釋度樣本中殘留的病毒量，每個(gè)稀釋度做4孔(各孔中應(yīng)該已經(jīng)長(zhǎng)滿單層的宿主細(xì)胞)，在37℃，放置1h~2h，以確保殘留病毒全部吸附在細(xì)胞上。取出培養(yǎng)板，更換細(xì)胞維持培養(yǎng)液。繼續(xù)放入二氧化碳培養(yǎng)箱中(37℃，5% CO ?)培養(yǎng)，逐日在顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，連續(xù)觀察3d，逐孔觀察并記錄細(xì)胞病變情況。終點(diǎn)稀釋法病毒感染滴度的計(jì)算：以半數(shù)細(xì)胞感染劑量表示。
9）噬斑法操作步驟：先用細(xì)胞維持培養(yǎng)液對(duì)待滴定樣本做10倍系列稀釋，然后接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，滴定各稀釋度樣本中殘留的病毒量。接種細(xì)胞前，將生長(zhǎng)致密的單層細(xì)胞中的培養(yǎng)液傾出，加入1ml待測(cè)樣品，放置37℃吸符1h~2h，傾出樣液，加入含0.8%瓊脂的細(xì)胞維持液3m1，冷卻后翻轉(zhuǎn)細(xì)胞瓶，放置37℃培養(yǎng)48h~72h。然后每瓶細(xì)胞加入2m1甲醛溶液固定數(shù)分鐘，用自來水沖洗后加結(jié)晶紫溶液染色數(shù)分鐘，沖洗干凈后計(jì)數(shù)。細(xì)胞瓶?jī)?nèi)圓形不著色的透明區(qū)即為一個(gè)蝕斑單位，每毫升測(cè)試樣品中的病毒含量計(jì)算：pfu/m1=平板平均蝕斑數(shù)×稀釋倍數(shù)。為了便于計(jì)數(shù)，病毒蝕斑數(shù)一般控制在每細(xì)胞瓶10pfu~30pfu。

試驗(yàn)分組
1）試驗(yàn)組。根據(jù)所測(cè)消毒劑對(duì)其他微生物的殺滅或滅活劑量估計(jì)，設(shè)定適宜的濃度與作用時(shí)間組（不少于1個(gè)濃度，3個(gè)作用時(shí)間)，對(duì)作用時(shí)間的設(shè)計(jì)應(yīng)不短于30s。
2）陽性對(duì)照組。用去離子水代替消毒劑，按試驗(yàn)組規(guī)定步驟加入脊髓灰質(zhì)炎懸液進(jìn)行試驗(yàn)和培養(yǎng)，觀察脊髓灰質(zhì)炎生長(zhǎng)是否良好。
3）陰性對(duì)照組。用不含脊髓灰質(zhì)炎的完全培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，觀察所用培養(yǎng)基有無污染，細(xì)胞是否生長(zhǎng)良好。

脊髓灰質(zhì)炎病毒殺滅 脊髓灰質(zhì)炎病毒殺滅試驗(yàn)，主要目的是測(cè)定消毒劑對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus，PV）滅活所需的劑量，以驗(yàn)證病毒污染物消毒實(shí)用劑量。脊髓灰質(zhì)炎病毒殺滅試驗(yàn)的試驗(yàn)原理在于，用細(xì)胞感染法測(cè)定消毒劑作用前后(或?qū)嶒?yàn)組與對(duì)照組)樣本中脊髓灰質(zhì)炎的量，以細(xì)胞病變作為判斷指標(biāo)，確定各組病毒的感染滴度，計(jì)算消毒劑對(duì)脊髓灰質(zhì)炎的滅活率。