母子分離加早期離乳，雄性大鼠顯示焦慮行為，而雌性大鼠未顯示焦慮行為。在非應(yīng)激狀態(tài)下（ Y迷宮實驗），雌性大鼠空間工作記憶能力下降。在應(yīng)激狀態(tài)下（Barnes迷宮實驗），雌性和雄性大鼠的空間參考記憶能力均未受損。條件恐懼實驗結(jié)果顯示，雄性大鼠環(huán)境相關(guān)的恐懼記憶能力增強(qiáng)。電生理實驗結(jié)果顯示，雄性大鼠前額皮層谷氨酸能神經(jīng)元的興奮性下降，可能是其焦慮行為的產(chǎn)生機(jī)制之一。母子分離加早期離乳對成年大鼠影響的性別差異，還需要進(jìn)一步研究。

該研究在已報導(dǎo)的小鼠母子分離加早期離乳應(yīng)激方法基礎(chǔ)上，首次制備了大鼠母子分離加早期離乳應(yīng)激模型，注重了應(yīng)激因素的累計效應(yīng)，更接近臨床。本模型對于揭示早期生活應(yīng)激事件和成年后神經(jīng)精神障礙的關(guān)系及分子機(jī)制研究具有一定意義。本模型的其他病理生理機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。

本模型不涉及除遺傳物質(zhì)重組對環(huán)境生態(tài)影響以外的其它安全性問題，本模型小鼠的保存、使用和處理均按照研究所倫理和安全委員會的要求執(zhí)行，可以確保不產(chǎn)生安全性問題。

1.MSEW雄性大鼠出現(xiàn)焦慮行為。空場實驗和高架十字迷宮實驗是用于評價大小鼠焦慮行為的實驗方法。空場實驗中，動物在中央?yún)^(qū)時間減少或高架十字迷宮實驗中，動物在開臂時間和中央?yún)^(qū)時間減少，閉臂時間增多，均提示動物焦慮行為增強(qiáng)。本實驗結(jié)果表明（圖1），雄性大鼠MSEW模型中央?yún)^(qū)時間減少。高架十字迷宮實驗結(jié)果表明（圖2），雄性大鼠MSEW模型開臂百分比，向下探頭次數(shù)均減少。上述實驗結(jié)果均提示雄性大鼠MSEW模型，而雌性大鼠無上述表現(xiàn)。

圖1 MSEW大鼠模型空場實驗中央?yún)^(qū)時間（A）及高架十字迷宮實驗開臂時間百分率（OT%）向下探頭次數(shù)（B）、中央?yún)^(qū)時間（C）及在閉臂中的時間（D）

2.MSEW雌雄性大鼠聯(lián)想學(xué)習(xí)無損傷，但MSEW雄性大鼠環(huán)境相關(guān)的恐懼記憶增強(qiáng)。條件性恐懼實驗是由一個條件刺激（聲音、光照）與一個引起強(qiáng)烈恐懼反應(yīng)的非條件刺激（足底電擊）結(jié)合而成，當(dāng)條件刺激與非條件刺激產(chǎn)生聯(lián)想，生成條件性恐懼記憶，動物表現(xiàn)為僵直時間增長。本實驗中，動物在條件恐懼訓(xùn)練箱中適應(yīng)3 min，對動物進(jìn)行5個循環(huán)的訓(xùn)練，每輪訓(xùn)練包括：接受聲音刺激（30s，5000HZ，70dB），聲音刺激的最后1 s給予電流刺激（0.65 mA ,1s）。每輪訓(xùn)練間隔30 s。24 h后，將動物放入同一訓(xùn)練箱。無聲音刺激，無電擊，記錄5 min 內(nèi)的木僵行為（freezing ），檢測環(huán)境相關(guān)的條件性恐懼記憶。

實驗結(jié)果顯示，訓(xùn)練階段，MSEW雌雄性大鼠聯(lián)想學(xué)習(xí)無損傷。環(huán)境相關(guān)的條件性恐懼記憶測試中，MSEW雄性大鼠恐懼記憶增強(qiáng)。

圖2MSEW大鼠模型條件性恐懼訓(xùn)練階段不動時間（A）及環(huán)境相關(guān)的條件性恐懼實驗不動時間（D）

3. MSEW雌性大鼠顯示空間工作記憶能力輕微下降。Y迷宮空間識別實驗可用于空間工作記憶測試。訓(xùn)練期，關(guān)閉一個臂，讓大鼠在其他兩個臂自由探索5min. 15min間隔后進(jìn)入測試期，打開之前關(guān)閉的臂（新臂），大鼠在三個臂自由活動5min，記錄大鼠在各個臂探索的時間和路程，空間工作記憶損害的動物在新臂中探索的時間和路程會縮短。本實驗結(jié)果顯示，雌性大鼠在測試期第一分鐘內(nèi)探索新臂時間雖增多，但與其他臂比較，無顯著性差異。雄性大鼠探索新臂時間增多，與其他臂比較，有顯著性差異。

圖3雌雄MSEW大鼠模型在Y迷宮實驗測試期第一分鐘內(nèi)探索各臂時間的時間（A,B）

4. MSEW雌雄大鼠空間參考記憶無損傷。Barnes迷宮實驗可用于檢測動物的空間參考記憶能力。Barnes迷宮尺寸為直徑120cm的白色啞光圓盤，上有12個直徑10cm圓洞，等距分布在圓盤邊緣，逃避盒固定在某一目標(biāo)洞下。實驗時伴有強(qiáng)光（白熾燈，250 lux）和噪音刺激（吹風(fēng)機(jī)，80 db）。在Barnes圓盤周圍放置圓形、方形等空間參照物。適應(yīng)階段：將實驗鼠放于逃避盒中適應(yīng)2 min。訓(xùn)練階段：將動物放于巴恩斯迷宮平臺中央的起始盒中，5ｓ后移走起始盒，打開實驗平臺上的光源和吹風(fēng)機(jī)，實驗動物以隨機(jī)方向開始探索迷宮，若動物成功進(jìn)入躲避盒，關(guān)掉吹風(fēng)機(jī)，使其躲避盒中適應(yīng)30 s（蓋上蓋子），若實驗鼠在4 ｍｉｎ內(nèi)未進(jìn)入躲避盒，則由實驗者引導(dǎo)進(jìn)入，并令其在躲避盒中適應(yīng)30 s。每次實驗間隔用７５％酒精擦拭迷宮表面和躲避盒并轉(zhuǎn)動迷宮，消除上次實驗過程中實驗鼠遺留的氣味和排泄物線索，確保實驗鼠通過自身空間記憶線索找到目標(biāo)洞。目標(biāo)洞始終固定于同一方位，每天訓(xùn)練3次，每次4 min，訓(xùn)練2d。從第二次訓(xùn)練開始，每次訓(xùn)練之前將迷宮隨機(jī)轉(zhuǎn)動一至數(shù)個洞的位置，但目標(biāo)箱始終固定在同一方位。空間探索階段：訓(xùn)練結(jié)束后24 h，進(jìn)行空間探索實驗。移除目標(biāo)洞，實驗動物自由探索迷宮90s，測試其空間記憶能力。本實驗結(jié)果顯示，雌雄大鼠MSEW模型對Barnes迷宮實驗訓(xùn)練期和探索期尋洞潛伏期與對照組相比，均無顯著性差異。

圖4雌雄MSEW大鼠模型在Barnes迷宮實驗訓(xùn)練期（A,B）尋洞潛伏期及探索期尋洞潛伏期及在目標(biāo)洞周圍的時間（C,D）

5. MSEW 雌雄大鼠前額皮層谷氨酸能神經(jīng)元電生理變化。MSEW 雌雄大鼠前額皮層神經(jīng)元的閾值和幅度沒有影響。在400和500pA刺激下，MSEW雄性大鼠谷氨酸能神經(jīng)元動作電位數(shù)目減少，提示神經(jīng)元興奮性下降。

圖5雌雄MSEW大鼠模型前額皮層谷氨酸能神經(jīng)元閾值和幅度（A,B）及400和500pA刺激下，產(chǎn)生的動作電位數(shù)目（C,D）

1. 實驗動物及分組：SD孕鼠。實驗分為雌性對照，雌性MSEW組，雄性對照，雄性MSEW組。

2. 實驗儀器：曠場實驗箱、高架十字迷宮實驗箱、條件性恐懼測試分析系統(tǒng)

3. 實驗操作規(guī)程：

大鼠幼崽出生第二天至第五天(postnatal day，PND2-5天)，從母鼠家籠移出，放置在另外房間的母子分離實驗箱，4h/d, 實驗箱分隔成開放獨立的小隔間，每個隔間內(nèi)放置一只幼崽。實驗箱放在加熱墊上，溫度維持在32℃左右。PND 6-16天, 母子分離8 h/d，母子分離實驗在光照期進(jìn)行，固定在8:00-18:00時間段。PND17天,大鼠幼崽離乳，雌雄分籠。正常對照組幼崽始終在母鼠家籠，至PND 21天離乳，正常換水，換料，其余不予干擾。PND 6O天，進(jìn)行空場實驗、高架十字迷宮實驗、新物體識別實驗、Y迷宮實驗及Barnes 迷宮實驗。行為學(xué)實驗結(jié)束，每組取3只動物，麻醉，取腦，進(jìn)行前額皮層神經(jīng)電生理檢測。

生命早期（胚胎、新生兒、幼年）是機(jī)體腦發(fā)育的關(guān)鍵時期，對應(yīng)激的敏感性極高。該時期的應(yīng)激因素（如喪親、長期與父母分離以及兒童期受虐或忽視），可破壞腦的結(jié)構(gòu)和功能的形成，對機(jī)體產(chǎn)生長期甚至是終生的影響，其中對情緒和認(rèn)知功能的影響最大，是青少年及成年神經(jīng)精神疾患的高風(fēng)險因素之一。

大鼠對環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)更為敏感，本研究建立了大鼠母子分離加早期離乳（Maternal separation with early weaning, MSEW）應(yīng)激模型，用于模擬生命早期應(yīng)激事件。這種雙重應(yīng)激模型更好的模擬了人類累計的應(yīng)激效應(yīng)（“cumulative”stress）導(dǎo)致青少年和（或）成年發(fā)生神經(jīng)精神疾患的現(xiàn)象。本研究觀察了MSEW模型雌雄大鼠成年的行為學(xué)表型和神經(jīng)電生理變化。