該動物模型主要是通過顯微注射法完成模型制備，再運用基因組PCR方法對相關轉基因和敲除基因進行鑒定和分析。

之前的HCV感染模型主要基于黑猩猩；由于小鼠易繁殖，基因操作性強，雖然HCV在小鼠上感染困難，但基于先進的基因組操作技術，近幾年來，轉基因小鼠成為HCV模型研究熱點。主要有轉基因模型、異種移植小鼠。后者主要是通過將人肝細胞（如肝癌細胞系或者原代肝細胞）移植入小鼠體內，形成人肝移植小鼠；該類免疫機能缺失小鼠模型不能用于研究宿主對HCV的特異性適應性免疫反應和再現病毒整個生命周期。前者通過表達HCV基因單個蛋白組分產物或基因多個蛋白組合產物模型和表達人宿主分子或失活小鼠抑制性分子構建小鼠模型（人源化模型）。有研究通過瞬時表達HCV四受體分子于小鼠上卻并未取得成功感染，在此基礎上同時穩定表達人CD81和OCLN分子的近交鼠能使HCV成功感染{Giang, 2012 #193}{Dorner,2011 #194}。

該模型繼承了之前小鼠模型的方便繁殖等優點，在前人基礎上運用轉基因技術和CRISPER/Cas9技術敲除相關基因，能提供HCV入侵受體的同時，敲除了STAT1能使天然免疫應答受限但并未缺陷小鼠的適應性應答，更加利于HCV在小鼠體內長期感染，用于HCV慢性感染研究，為疫苗探索提供模型基礎。

動物模型制備過程中的監督管理、處置措施、微生物菌株管理、細胞系描述、遺傳分析、對環境和生態影響的評估均符合相關規定。

模型構建與檢測數據如下：

對該動物模型進行HCV感染驗證：尾靜脈注射HCV三個月后，對HCV RNA通過RT-PCR方法進行驗證：

除非特別說明，本發明采用的試劑、設備儀器為本技術領域常用試劑盒儀器，均可從商業途徑得到。pFUW-CSCO-4hEF載體質粒是王天翼研究員惠贈，見圖1所示

1） CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受體轉基因ICR小鼠構建（北京維通達生物技術有限公司）

pFUW-CSCO-4hEF載體質粒經過NdeI內切酶（NEB， #R0111V；Cutsmart buffer： NEB， #B7204S）消化，得到線性DNA片段；將線性化DNA片段經顯微注射入ICR小鼠受精卵，移入假孕小鼠子宮內；小鼠出生后，提取基因組，采用跨啟動子區域設計特異性引物Primer1，檢測篩選得到的陽性F0小鼠（PCR產物片段為872bp），再用Primer2對插入的目的基因進行檢測鑒定（PCR產物片段1643bp），獲得CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受體轉基因ICR子代小鼠（簡稱4hEFTg）；

PCR特異性引物序列如下：

Primer1：

F：5’CGGAACAGGCGAGGAAAAGT

R：5’ACAAAACACACTCGCCAACC

Primer2：

F：5’ CCTGTCATCTGCCAAATCCG

R：5’ TACTGATCCACGTAGAGTCCA

PCR反應體系：

PCR程序：

2）構建純合STAT1-/-小鼠模型（北京華阜康生物科技股份有限公司）

針對STAT1基因第一外顯子和第二外顯子序列，設計2對sgRNA序列，通過構建STAT1基因敲除載體并體外轉錄獲得sgRNA

在NCBI上查詢小鼠STAT1基因信息，根據靶點序列和脫靶位點、發生錯配可能性大小進行設計和評估篩選，核苷酸序列和由公司（上海英濰捷基）合成的sgRNA序列如下所示；

位點1：actccaagttcctggagc agG

sgRNA序列：

m-STAT1-grna-up1 5’ATGGactccaagttcctggagc

m-STAT1-grna-down1 5’AAACGCTCCAGGAACTTGGAGT

位點2：cct cctctcacagctggacga

sgRNA序列：

m-STAT1-grna-up2 5’ATGGTCGTCCAGCTGTGAGAGG

m-STAT1-grna-down2 5’AAACcctctcacagctggacga

合成的sgRNA單鏈通過退火復性結合成小片段，插入BSAⅠ線性化的pUC57-sgRNA載體，通過體外轉錄成為可注射的sgRNA（體外轉錄試劑盒：Ambion Am1354）。

pST1374-NLS-flag-linker-Cas9載體通過體外轉錄成為可注射的Cas9-RNA（體外轉錄試劑盒：AmbionAm1345）。

經顯微注射入ICR小鼠受精卵；

受精卵移植入ICR假孕雌鼠子宮；

小鼠出生7-10天后，剪取腳趾和尾尖，提基因組DNA（全式金Transgen公司的基因組DNA提取試劑盒 EE101-12），根據STAT1基因序列信息設計PCR檢測引物（上海英濰捷基），經PCR方法檢測敲除基因型，得到陽性F0代小鼠（STAT1+/-）;

PCR檢測引物：

m-STAT1-ko-S 5’gagagtaatttaatggttgggctc

m-STAT1-ko-A 5’CATGTGAGTCCTGTATCCCTCTAATAGTAAC

TM=63℃

PCR反應體系及擴增程序（TaKaRaRR042A）

反應體系：

10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+ Plus)

2.0 μl

dNTP Mixture(2.5 μM)

1.6 μl

引物-S（50 μM ）

0.2 μl

引物-A（50 μM ）

0.2 μl

模板DNA

2.0 μl

LA Taq

0.2 μl

補加ddH2O至總體積

20.0μl

擴增程序：

6×loadingbuffer 終止反應。

用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳。

鑒定結果如圖2所示，鑒定出兩種條帶型，選取檢測分子量不同于野生型條帶的目的條帶進行TA克隆，之后用檢測引物進行菌液PCR，篩選有插入的克隆測序。即獲得的小鼠為雜合子STAT1+/-小鼠（WT條帶大小：1081bp）；

F0代小鼠經自交，出生小鼠經基因組PCR方法鑒定，獲得純合STAT1-/-小鼠。

3）構建CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受體轉基因合并STAT1基因敲除ICR小鼠動物模型

將純合STAT1-/-小鼠與4hEFTg小鼠雜交，出生小鼠經PCR方法檢測STAT1基因敲除情況和四受體基因表達情況（PCR檢測引物見上述構建方法），獲得含CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受體轉基因陽性STAT1雜合敲除的F1代4hEFTg STAT1+/-小鼠；

F1代4hEFTg STAT1+/-小鼠自交，出生小鼠經PCR擴增測序檢測，鑒定STAT1基因敲除情況和四受體基因表達情況（PCR檢測引物見上述構建方法），得到基因型，獲得含CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受體轉基因陽性合并STAT1純合敲除的F2代4hEFTg STAT1-/-小鼠，即為小鼠動物模型。

4）利用4hEFTg STAT1-/-小鼠進行HCV感染評價

丙型肝炎病毒JFH1通過尾靜脈注射（1x10^7FFU）感染4hEFTg STAT1-/-小鼠，感染3月后取小鼠肝組織。用qRT-PCR方法（QIAGEN 210210）檢測肝細胞中的HCV RNA，1%DNA膠鑒定產物結果。相對于野生型ICR小鼠組，4hEFTg STAT1-/-小鼠組能檢測到HCV RNA，顯示4hEFTgSTAT1-/-小鼠能成功感染HCV。

丙型肝炎主要病因是丙型肝炎病毒感染引起，HCV感染極易慢性化，HCV感染與肝癌的發生有密切關系。HCV的致病機制與病毒的直接致病作用和免疫病理損傷有關，包括HCV干擾細胞內大分子合成等的直接殺傷作用、HCV特異性CD8和CD4 T細胞免疫應答、宿主自身免疫因素的參與以及細胞凋亡。 HCV主要傳染源是急慢性患者和無癥狀病毒攜帶者，通過腸道外途徑如血制品、注射、密切接觸等傳播，人類普遍對HCV易感，目前尚無疫苗。 丙型肝炎臨床表現為急性肝炎包括急性黃疸型肝炎和急性無黃疸型肝炎；超過半年或原有肝炎急性發作后再次出現肝炎癥狀、體征和肝功能異常者發展為慢性肝炎，嚴重者在多種復雜因素下進展為重型肝炎。根據臨床表現的嚴重程度，亞急性重型肝炎和慢加急性重型肝炎可分為早、中、晚期。除此之外，肝炎還表現為淤疸型肝炎、肝炎肝硬化。可發生嚴重并發癥如肝性腦病、上消化道出血、肝腎綜合征和感染。

往往通過有無輸血及血制品、靜脈吸毒、血液透析多個性伴侶、不潔注射及紋身等病史，以及相應肝功能臨床診斷，和有無HCV抗體IgM或IgG、HCV RNA陽性進行診斷。

1、CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受體基因和STAT1基因信息

CD81(gen ID：975)、CLDN1(genID：9076)、OCLN(gen ID：100506658)、SRB1(genID：949)、STAT1（genID：6772）從GenBank數據庫上獲得。

2、實驗動物背景信息

實驗動物選擇遠交系ICR品系，是1973年從日本國立腫瘤研究所引進。購于北京維通達生物技術有限公司和北京華阜康生物科技股份有限公司。此鼠溫順，生育能力高。

3、研究背景

丙型肝炎病毒（HCV）是經血液傳播病毒，感染人類后易慢性化。病毒的持續存在可使肝炎向肝脂肪病變、肝纖維化、肝硬化甚至肝細胞癌進展，嚴重威脅人類健康。在世界范圍，據估計，2015年病毒性丙型肝炎的患病率為1.0%（95%的不確定區間為0.8-1.1），有7100萬（62.5-79.4）為慢性病毒性感染。目前尚無HCV疫苗，而疫苗研發難點除了HCV基因組差異大，不同基因型的病毒序列差異可高達50%{Bukh, 1995 #111}{Simmonds, 2005 #112}，在感染機體內常以準種形式存在外，目前缺乏合適的動物模型也限制了HCV疫苗的研發應用。

HCV自然宿主是人和黑猩猩，由于靈長類動物費用高和倫理問題復雜，限制了該類動物的應用。近幾年，國內外學者已經在小型動物模型上進行各種嘗試，已取得部分進展，主要有：

（1）樹鼩模型：樹鼩對HCV易感，一些動物在初次感染3年后疾病可進展成肝纖維化和肝硬化{Amako,2010 #155}。但樹鼩屬于野生動物，遺傳品系不穩定，應用受限。

（2）HCV基因轉基因小鼠模型：可表達表達HCV基因單個蛋白組分產物或基因多個蛋白組合產物，但會由于表達HCV產物的不同、小鼠背景的差異性或HCV蛋白表達所用啟動子不同而出現組織病理報告差異大，表現為不同程度的肝疾病，使針對發病機制研究時需要多加注意。

（3）異種移植小鼠模型：通過將人肝細胞（如肝癌細胞系或者原代肝細胞）移植入小鼠體內，形成人肝移植小鼠。該類小鼠模型免疫缺陷，不能用于研究宿主抗HCV的特異性適應性免疫反應和再現病毒整個生命周期。

（4）宿主因子人源化小鼠模型：在HCV感染人體過程中有四個（CD81、SCARB1、CLDN1和OCLN）入侵必需宿主因子，其中CD81第二個包外環關鍵氨基酸殘基和OCLN分子是阻止HCV入侵嚙齒動物細胞的原因。利用腺病毒瞬時表達人CD81單分子或同時表達人CD81、SCARB1、OCLN和CLDN1四種分子的小鼠模型卻并未成功建立HCV感染{Masciopinto, 2002#191}{Hikosaka, 2011 #192}。在近交鼠上同時穩定表達人CD81和OCLN分子能使HCV成功入侵，但小鼠的免疫系統限制了HCV的感染{Dorner, 2011 #194}，在此基礎上敲除STAT1-/-，該小鼠能成功建立HCV感染，并能激活適應性免疫反應。

為解決現有丙型肝炎病毒感染小鼠模型缺乏，目的在于提供了一種構建CD81、CLDN1、OCLN、SRB1四受體轉基因合并STAT1基因敲除小鼠模型，用于HCV感染動物模型和HCV疫苗探索研究的模型基礎。